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體外重組蛋白表達(dá)的蛋白純化標(biāo)簽如何選擇
體外重組蛋白表達(dá)技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學(xué)的各個領(lǐng)域。目前,體外重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要有四類:原核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)、酵母表達(dá)系統(tǒng)及昆蟲細(xì)胞表達(dá)。表達(dá)的一般實驗包括載體構(gòu)建-表達(dá)鑒定-蛋白純化三大步驟。在構(gòu)建載體階段,除了一些必要的表達(dá)元件,還需要考慮的密碼子優(yōu)化和標(biāo)簽的選擇。選擇合適的標(biāo)簽不但有利于蛋白的純化,促進(jìn)蛋白的可溶性,同時也不能影響蛋白的結(jié)構(gòu)功能和下游應(yīng)用。感謝使用上海金鵬蛋白純化系統(tǒng)Blupadstart進(jìn)行蛋白純化分離實驗。
本文詳細(xì)介紹了幾種蛋白純化標(biāo)簽,幫助我們更好的設(shè)計實驗。
蛋白純化標(biāo)簽比較
融合標(biāo)簽 |
大?。↘D) |
功能 |
是否切除 |
HIS |
0.84 |
有利純化,能純化可溶性/包涵體蛋白 |
標(biāo)簽小,對蛋白無影響 |
GST |
26 |
增強(qiáng)蛋白可溶性,僅能純化可溶性蛋白,屏蔽毒性蛋白 |
標(biāo)簽較大,影響較大 |
MBP |
44.4 |
增強(qiáng)蛋白可溶性,屏蔽毒性蛋白 |
NusA |
55 |
增強(qiáng)蛋白可溶性,屏蔽毒性蛋白 |
SUMO |
11.2 |
增強(qiáng)可溶性,屏蔽毒性蛋白 |
表1:各個標(biāo)簽性能對比表
HIS-Tag(組氨酸標(biāo)簽)
HIS-Tag蛋白純化的標(biāo)簽HIS-Tag本身的特性對目的蛋白沒有影響,不會形成二聚體;
- 分子量較小,只有0.84KD,對蛋白的下游應(yīng)用不會產(chǎn)生影響;
- 免疫原性低,可將純化的蛋白直接注射動物進(jìn)行免疫并制備抗體;
- HIS-Tag與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制兼容,有利于蛋白表達(dá);
- 可與其他標(biāo)簽構(gòu)建雙標(biāo)簽表達(dá),可用于多種蛋白表達(dá)系統(tǒng),純化條件溫和對蛋白影響較小。
GST-Tag(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽)GST-Tag相對分子質(zhì)量較大,約為26KD,插入在目的蛋白的C末端或N末端,大腸桿菌中常用在N端。GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶) 蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶。一般選擇GST標(biāo)簽的目的有兩個,一是提高蛋白表達(dá)的可溶性,二是提高蛋白的表達(dá)量。蛋白表達(dá)純化結(jié)束后需根據(jù)不同的蛋白應(yīng)用而確定是否切除標(biāo)簽,標(biāo)簽較大,切除與否需根據(jù)下游應(yīng)用考慮。如果要去除GST融合部分,可用位點特異性蛋白酶切除。檢測方法可用GST抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測。
HIS-Tag由6-10個組氨酸殘基組成,分子量不到0.84KD,,通常插入在目的蛋白的C末端或N末端。HIS-Tag是目前原核表達(dá)常用的標(biāo)簽,蛋白純化完之后可以不需切除此標(biāo)簽,也不會對蛋白產(chǎn)生功能影響。同時,蛋白純化步驟簡便,純化條件溫和,對蛋白也不會產(chǎn)生太大影響。
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