常用的蛋白純化技術(shù)介紹
摘要：本文介紹了在蛋白表達(dá)純化試驗(yàn)中，對(duì)不同來源的材料的預(yù)處理。主要從植物，動(dòng)物和微生物三種源材料的特點(diǎn)和注意事項(xiàng)進(jìn)行描述，并附有原核蛋白表達(dá)的案例。
蛋白質(zhì)在分子生物學(xué)中的分類，大體上可分為天然蛋白和重組蛋白。提取天然蛋白和構(gòu)建重組蛋白都需要先確定生物原材料，如植物材料主要以植物的葉，胚，果實(shí)和根莖等為主；動(dòng)物通常是選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的器官和組織；而微生物則是微生物菌體本身或發(fā)酵液。從原則上講，任何一種自然界中存在或不存在的蛋白質(zhì)都可以被外源表達(dá)出來，像原核蛋白表達(dá)就是以大腸桿菌（E.coli）為宿主菌表達(dá)克隆基因，在原核表達(dá)體系中，重組蛋白的含量比雜蛋白的含量高的多，所以選擇和設(shè)計(jì)合適的分離純化方案對(duì)于重組蛋白表達(dá)純化的下游實(shí)驗(yàn)就顯得尤為重要。
在提取和分離蛋白時(shí)有以下幾點(diǎn)需要注意：
蛋白質(zhì)提取應(yīng)盡量多的提取出活性蛋白，避免各因素導(dǎo)致目的蛋白失活；
選用不同的溶劑提取分離蛋白質(zhì)（大多數(shù)蛋白溶于水，稀鹽，稀酸等，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白則溶于乙醇等有機(jī)溶劑）；
提取蛋白一般在低溫環(huán)境中操作，避免蛋白質(zhì)在提取過程中降解（可加入蛋白酶控制劑，如PMSF、EDTA、antipain 和 leupeptin等）；
提取時(shí)緩沖液的用量通常是原材料的1~5倍，提取時(shí)注意均勻攪拌，這樣有利于蛋白的溶解（緩沖液通常選用PH≈7,0.15mol/L磷酸鹽緩沖液或PH7.5,0.1mol/L Tris-Hcl緩沖液）；
蛋白質(zhì)提取常用各種水溶液，一般是在偏離等電點(diǎn)0.5pH以上，此時(shí)蛋白的溶解度增加；
用稀酸提取等電點(diǎn)在堿性范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，用稀堿提取等電點(diǎn)在酸性范圍內(nèi)的蛋白，盡可能提高目的蛋白在提取液中的溶解度。
不同材料的處理：
1. 植物材料的預(yù)處理
植物體內(nèi)通常存在著為數(shù)眾多的天然蛋白，提取時(shí)通常選用一些器官為主要原料。但植物提取蛋白時(shí)存在一些特殊問題，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的得率較動(dòng)物和微生物的要低。
因?yàn)橹参锊牧现谐康牡鞍淄膺€含有大量的淀粉，纖維素和果膠等雜志，所以初步的均質(zhì)化處理需要在大量緩沖液中進(jìn)行，初步過濾后得到低濃度蛋白，之后需要進(jìn)行硫酸銨沉淀和PEG沉淀進(jìn)行分離，分離后的蛋白可與其他蛋白一樣，采用一般的蛋白純化處理。
2. 動(dòng)物材料的預(yù)處理
動(dòng)物原材料組織中含有豐富的目的蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)所處的不同位置（胞內(nèi)，胞外，亞細(xì)胞器等），應(yīng)選用不同的組織破碎方式。對(duì)于少量組織，可使用小型均質(zhì)器，大量組織則采用搗碎機(jī)快速搗碎方法。對(duì)于軟組織，可使用玻璃均質(zhì)器。組織均質(zhì)化后，將不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的蛋白酶釋放到溶液中，使之與目的蛋白接觸并降解，再進(jìn)行純化處理。
注意：均質(zhì)化時(shí)間盡可能短，減少不必要的蛋白質(zhì)水解變性
在4℃預(yù)冷的緩沖液中進(jìn)行均質(zhì)化處理和后期分離操作，有助于降低蛋白質(zhì)水解
 在緩沖液中添加蛋白酶控制劑控制蛋白質(zhì)水解
3. 微生物材料的預(yù)處理
微生物可產(chǎn)生多種天然蛋白和重組蛋白，提取天然蛋白，首先要對(duì)大量菌株篩選獲得高產(chǎn)菌株，再進(jìn)行誘變育種分離產(chǎn)量更高的正突變菌株，再通過基因工程技術(shù)提高內(nèi)源微生物蛋白產(chǎn)量。而重組蛋白的提取相對(duì)來說就簡(jiǎn)單地多，微生物可以通過發(fā)酵的方式，短時(shí)間內(nèi)大量培養(yǎng)，從而分離出大量可純化的目的蛋白。與植物和動(dòng)物處理方法相比較，微生物蛋白通常比來源于植物和動(dòng)物的相同蛋白質(zhì)要更加穩(wěn)定，也更易于遺傳學(xué)操作。只要篩選出正確的培養(yǎng)條件，就可以獲得大量的特定蛋白質(zhì)菌體。
4. 細(xì)菌的裂解
細(xì)胞的破碎裂解是指用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械等方法破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，從而將胞內(nèi)物質(zhì)（目的蛋白）釋放到周圍環(huán)境的過程。針對(duì)不同用途和類型的細(xì)胞壁發(fā)展了多種方法，目前常用方法大體上可分為機(jī)械法和非機(jī)械法倆類，常用的機(jī)械破碎法有：高溫珠磨法；高壓勻漿；超聲破碎法。而非機(jī)械法包括滲透壓沖擊法；凍融破碎法；酶溶法；化學(xué)破碎法等。下面介紹在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛的酶溶法和超聲破碎法。
酶溶法
常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要作用于細(xì)菌類，而其他幾種酶對(duì)酵母作用較為顯著。
主要步驟為：
4 ℃，5000rpm 離心15 min，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 mL）。棄上清，每克濕菌內(nèi)加3 mL
裂解緩沖液，懸浮沉淀；
沉淀稱量，每克菌內(nèi)加8mL PMSF及80mL溶菌酶，攪拌20 min；邊攪拌邊每克菌加4 mg脫氧膽酸
（低溫中進(jìn)行）；
37 ℃，玻棒攪拌，至溶液粘稠時(shí)每克菌內(nèi)加20mL DNase I。室溫放置至溶液不再粘稠。
超聲破碎法
聲頻為 15-20 kHz 的超聲波在強(qiáng)度聲能輸入下可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，在處理少量樣品時(shí)具有操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，節(jié)省時(shí)間，液體量損失較少等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還可對(duì)染色體DNA進(jìn)行剪切，降低液體的粘稠度。
主要步驟為：
收集 1 L 誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，40 ℃ ，5000

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